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斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(Post-weaning multisystemic wasting syndrome, PMWS)是由豬圓環(huán)病毒2型病毒引起的斷奶仔豬漸行性消瘦并發(fā)反復(fù)性腹瀉和咳嗽為特征的一種傳染病。該病毒能嚴(yán)重侵害斷奶仔豬免疫系統(tǒng)，使患病仔豬免疫抑制而并發(fā)或繼發(fā)各類細(xì)菌性或其他條件性疾病，導(dǎo)致規(guī)模豬場仔豬死亡率增加和經(jīng)濟(jì)效果顯著降低，嚴(yán)重影響?zhàn)B豬業(yè)的發(fā)展。目前，該病毒以隱性感染潛伏于母豬及仔豬機(jī)體導(dǎo)致規(guī)模豬場病死率增加的報(bào)道較多，在全世界廣泛流行和感染。
疫苗免疫是防控豬圓環(huán)病毒病的主要手段和措施。但豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒病及其他免疫抑制性疾病的隱性感染使該病免疫失敗報(bào)道較多，劉建波、唐慧穩(wěn)等探討了針對斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合的防控措施，有效地減緩了該病對養(yǎng)豬業(yè)的危害。本文利用探討的免疫程序制備豬圓環(huán)病毒2型高免血清抗體，從預(yù)防和緊急治療探討該抗體對豬多系統(tǒng)衰竭綜合征的防控效果，現(xiàn)將具體研究內(nèi)容報(bào)道如下。
試驗(yàn)材料與動(dòng)物
主要藥品與試劑
豬圓環(huán)狀病毒2型基因工程次單位疫苗、豬圓環(huán)病毒2型診斷試劑盒、硫柳汞鈉；培養(yǎng)基、1moL/L氫氧化鈉、1moL/L HCl、25%葡萄糖、25%黃芪多糖注射液等，由實(shí)驗(yàn)室自配，均在有效期內(nèi)。
試驗(yàn)動(dòng)物和試驗(yàn)豬場
免疫血清抗體來自重慶市榮昌縣昌元鎮(zhèn)石河村某小型養(yǎng)豬戶飼養(yǎng)的10頭60kg左右生長育肥榮昌土雜豬；試驗(yàn)豬場為原重慶市墊江縣中華養(yǎng)豬場；試驗(yàn)動(dòng)物為該中華養(yǎng)豬場疑似感染豬圓環(huán)病毒2型的60頭斷奶外三元雜交商品仔豬、9頭200kg左右長白種母豬和2頭杜洛克種公豬，試驗(yàn)用斷奶仔豬及種公豬、種母豬均未有豬圓環(huán)病毒疫苗免疫史。
豬圓環(huán)病毒2型高免血清抗體的制備
免疫和血漿的收集
對10頭60kg左右的生長育肥豬按每15d免疫1次，通過頸部肌肉注射免疫豬圓環(huán)病毒2型疫苗。首次注射量加倍，后按疫苗生產(chǎn)廠家參考使用劑量免疫，屠宰前2～5d按3倍劑量免疫。屠宰，無菌收集血液，加入3.8%抗凝劑，輕輕攪拌混勻，4℃靜置備用。
豬圓環(huán)病毒2型高免血清抗體的制備
5000rpm離心備用血漿，取上清液-20℃保存24～48h后解凍并過濾，濾液置500mL試劑瓶，按0.04%加入硫柳汞鈉和雙抗，混勻，編號，4℃保存?zhèn)溆?，即為制備的豬圓環(huán)病毒2型高免血清抗體。
豬圓環(huán)病毒2型高免血清抗體效價(jià)的測定
參照購買的豬圓環(huán)病毒2型ELISA檢測試劑盒操作步驟，對收集來自免疫豬圓環(huán)病毒2型疫苗的10頭育肥豬血清進(jìn)行抗體效價(jià)定性檢測，判定標(biāo)準(zhǔn)：以空白孔調(diào)零，在酶標(biāo)儀上測各孔OD630nm值。試驗(yàn)成立的條件是陽性對照孔平均OD630nm值≥0.7,陰性對照平均OD630nm值必須小于0.3。樣品OD630nm值大于0.42判為陽性；樣品OD630nm值介于0.38～0.42判為可疑；樣品OD630nm值小于0.38判為陰性。記錄檢測結(jié)果備用。
豬圓環(huán)病毒2型高免血清抗體制劑的配制
取250mL規(guī)格的滅菌燒杯，分別按6%、20%、20%加入制備的豬圓環(huán)病毒2型高免血清抗體、25%的黃芪多糖及25%葡萄糖, 混勻，分裝，編號，4℃保存?zhèn)溆?，即為制備的豬圓環(huán)病毒2型高免血清抗體制劑。
豬圓環(huán)病毒2型高免血清抗體制劑無菌檢驗(yàn)
參照姚火春等配制普通瓊脂培養(yǎng)基和肉湯培養(yǎng)基，37℃靜置24h作無菌檢驗(yàn)，選無菌檢驗(yàn)合格的兩種培養(yǎng)基4℃保存?zhèn)溆谩?/span>
取制備好的豬圓環(huán)病毒2型高免血清抗體制劑20mL，分別于肉湯、瓊脂培養(yǎng)基按2mL/管、2mL/個(gè)加入5管肉湯培養(yǎng)基和5個(gè)瓊脂培養(yǎng)基，分別混勻和涂勻，37℃靜置24～48h，觀察并記錄試驗(yàn)結(jié)果。
豬圓環(huán)病毒2型高免血清抗體制劑生物安全性試驗(yàn)
購買的12頭斷奶榮昌小公豬觀察5d，按3頭/組將其分為4組，即空白對照組、試驗(yàn)組1、試驗(yàn)組2和試驗(yàn)組3。試驗(yàn)組1、試驗(yàn)組2和試驗(yàn)組3分別按0.25mL/kg、0.5mL/kg、1mL/kg注射各組內(nèi)的3頭試驗(yàn)豬只，空白對照組不注射任何試劑，觀察7～10d，記錄注射豬只的呼吸、體溫、脈搏、糞便形狀、尿液色澤等常規(guī)生理指標(biāo)，記錄試驗(yàn)結(jié)果。
臨床對比試驗(yàn)
將待試驗(yàn)的60頭斷奶仔豬、9頭種母豬及2頭杜洛克種公豬分為預(yù)防組（簡稱Y，下同）、治療組（簡稱Z，下同）及空白對照組（簡稱K，下同）。具體分組見表1。其中，預(yù)防組Y-1于母豬產(chǎn)前1d、產(chǎn)后第5～7天分別按0.1mL/kg給母豬注射豬圓環(huán)病毒2型高免血清抗體制劑，仔豬于出生后第12～15天、斷奶前1d分別按0.2mL/kg注射豬圓環(huán)病毒2型高免血清抗體制劑，種公豬于每次直配前2d按0.1mL/kg注射豬圓環(huán)病毒2型高免血清制劑；預(yù)防組2按生產(chǎn)廠家提供的使用劑量分別于母豬配種前10 d免疫豬圓環(huán)病毒2型疫苗、產(chǎn)前1個(gè)月加免1次，仔豬于12～15日齡免疫豬圓環(huán)病毒2型，種公豬按上下半年各免疫1次，每次2頭份的免疫程序免疫豬圓環(huán)病毒2型疫苗；觀察出生到出生后40d，收集初生仔豬存活頭數(shù)、弱仔數(shù)、腹瀉數(shù)量、死亡數(shù)量等指標(biāo)，記錄試驗(yàn)結(jié)果，備用。
針對出現(xiàn)漸行性消瘦及反復(fù)腹瀉的斷奶仔豬，設(shè)置3組作對比試驗(yàn)，Z-1組給發(fā)病仔豬按0.3mL/kg肌肉注射豬圓環(huán)病毒2型高免血清抗體制劑的同時(shí)，頸部對側(cè)肌注恩諾沙星注射液，上下午各1次，連用2d；Z-2組按3倍劑量肌肉注射豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗，于緊急加倍免疫的第2天于注射疫苗的對側(cè)頸部肌肉注射恩諾沙星，上下午各1次，連用2d；Z-3組僅注射恩諾沙星注射液，上下午各1次，連用2d。三組均觀察10～15d，觀察試驗(yàn)豬群的腹瀉發(fā)生率、死亡率等，收集并記錄試驗(yàn)結(jié)果備用。
空白對照組仔豬和母豬均不注射豬圓環(huán)病毒2型病毒滅活疫苗，其他疫苗、保健等按豬場常規(guī)管理進(jìn)行操作，觀察并記錄該組母豬的初生仔豬存活率及平均頭數(shù)、仔豬腹瀉發(fā)生率及斷奶仔豬發(fā)病與死亡率等指標(biāo)。
表1 臨床試驗(yàn)分組
注：表中“3+1”代表試驗(yàn)的3頭經(jīng)產(chǎn)母豬及1頭公豬；20△代表試驗(yàn)的斷奶仔豬頭數(shù)。
結(jié)果
豬圓環(huán)病毒2型高免血清抗體的制備
于37℃恒溫靜置培養(yǎng)48h，3個(gè)營養(yǎng)肉湯不渾濁，無菌泥沉淀；3個(gè)瓊脂培養(yǎng)基未見菌落生長，表明制備的高免血清抗體未受污染，滿足后續(xù)試驗(yàn)要求；ELISA法檢測該高免血清，豬圓環(huán)病毒2型抗體效價(jià)均呈陽性，表明經(jīng)免疫豬圓環(huán)病毒2型疫苗的育肥豬制備的血清含有該病毒抗體，符合本試驗(yàn)的要求。
豬圓環(huán)病毒2型高免血清抗體制劑生物安全性試驗(yàn)結(jié)果
按0.25mL/kg、0.5mL/kg、1mL/kg分別注射試驗(yàn)用榮昌小公豬，除1 mL/kg劑量組于注射后2d內(nèi)有2頭試驗(yàn)豬出現(xiàn)精神略微沉郁、食欲略有降低外，其他各組包括空白對照組試驗(yàn)豬只體溫、食欲、呼吸頻率、糞便色澤及形狀、尿液色澤均正常；表明該抗體制劑在按1mL/Kg及其內(nèi)的劑量注射時(shí)對豬機(jī)體無毒性作用。
兩種生物防控法對疑似斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征臨床對比試驗(yàn)結(jié)果
具體結(jié)果見表2。表2可知，從預(yù)防的效果看，用制備的豬圓環(huán)病毒2型高免血清抗體制劑通過對經(jīng)產(chǎn)母豬、種公豬、初生仔豬作預(yù)防保健，其初生仔豬的存活頭數(shù)最高，3頭試驗(yàn)?zāi)肛i共生產(chǎn)38頭存活的初生仔豬，從出生到斷奶后30d內(nèi)的仔豬存活率也最高，達(dá)97%；用豬圓環(huán)病毒2型疫苗免疫其從出生到斷奶后30d的仔豬平均存活率其次，為86%；空白對照組最低，3頭試驗(yàn)?zāi)肛i提供的初生仔豬存活頭數(shù)及到斷乳后30d的平均存活率分別為33%和55%。
治療效果看，采取豬圓環(huán)病毒2型高免血清抗體制劑并結(jié)合對癥治療組其治愈率最高，為100%，其次是緊急加倍劑量免疫豬圓環(huán)病毒2型疫苗并結(jié)合對癥治療，治愈率為85%；單純采取對癥療法治愈率最低，僅70%。
表2 兩種生物防控法對疑似豬圓環(huán)病毒病的臨床試驗(yàn)對比結(jié)果(單位:%)
分析與討論
比較
血清抗體是用某種免疫原刺激動(dòng)物機(jī)體后漿細(xì)胞分泌產(chǎn)生的特異性產(chǎn)物，其含有的活性因子及特異免疫球蛋白對事先刺激的免疫原具體高度靈敏性和專一性。對豬免疫各種病原疫苗刺激機(jī)體產(chǎn)生有效抗體是規(guī)模豬場防控各種疾病的主要方式和途徑。不同于病原疫苗的常規(guī)預(yù)防功效，血清抗體更多用于疫病暴發(fā)時(shí)的緊急治療。兩種方法都是規(guī)模豬場防控疾病發(fā)生有效生物防控手段，但不同疫病環(huán)境下其兩種防控手段的防控效果各異，本研究通過免疫屠宰前60天左右的健康育肥豬并屠宰收集血液制備血清，從預(yù)防和緊急治療兩個(gè)方面用具體試驗(yàn)數(shù)據(jù)對豬圓環(huán)病毒2型疫苗和豬圓環(huán)病毒2型抗體制劑的防控效果作了比較，結(jié)果表明，在疑似已隱性感染有豬圓環(huán)病毒2型病毒的規(guī)模豬場，使用豬圓環(huán)病毒2型高免血清抗體制劑能收到更好的防控效果，從出生至斷乳后30d的存活率可達(dá)90%，有助于大大提高規(guī)模豬場斷乳仔豬成活率，是規(guī)模豬場斷奶仔豬可取的有效預(yù)防疫病發(fā)生的防控措施和方案。
不足
針對疑似隱性感染有豬圓環(huán)病毒2型的某規(guī)模豬場，本研究選擇免疫育肥豬制備豬圓環(huán)病毒2型血清抗體，由于時(shí)間和購買的試劑盒限制，本研究只通過試劑盒對制備的血清抗體進(jìn)行了定性檢測，其結(jié)果全部陽性盡管符合本研究的需要，但并不知道該血清抗體內(nèi)豬圓環(huán)病毒2型的抗體效價(jià)是本研究的一大遺憾。
驗(yàn)證
本研究從預(yù)防和緊急治療兩個(gè)方面探討用豬圓環(huán)病毒2型疫苗和豬圓環(huán)病毒2型血清抗體的防控效果，從試驗(yàn)的仔豬及母豬看，針對感染豬圓環(huán)病毒2型的規(guī)模豬場,給發(fā)病仔豬和母豬注射豬圓環(huán)病毒2型血清抗體并對癥使用敏感抗菌素，能有效提高初生仔豬存活頭及發(fā)病仔豬的存活率，這一方面驗(yàn)證豬圓環(huán)病毒2型易導(dǎo)致患病豬免疫抑制進(jìn)而繼發(fā)其他條件性致病的感染這一特點(diǎn)，又說明規(guī)模豬場其疾病的感染已不局限于單一疾病，更多是混合感染的特點(diǎn)。
